Cuaderno que recoge las prácticas realizadas de la asignatura.

Cuaderno de prácticas de biología molecular

En colectivo una compañera sí logró obtener cromosomas en metafase por lo que se pudo apreciar con clardiad en el microscopio con el lente de inmersión la forma de los cromosomas y pudimos diferenciar algún que otro cormosoma centrométrico

Cromosomas en metafase Éxito en el cultivo.

Linfoblastos

Se presenta pocos linfoblastos en la muestra puede ser porque está contaminada o no se ha hecho bien algún paso.

Una vez preparada la cabina de gases, etiquetamos el frasco, en escribimos la cantidad de ácido acético (1 ml) y 30 ml de metadona. 

Realizaremos el fijador Carnoy el cual se usará para el cariotipo de sangre periférica.

-Ácido Acético -Metanol -Gradilla -Frasco

A continuación pipeteamos dentro de la cabina, lo haremos con precaución de la siguiente manera: -Abrimos el bote de reactivos (ya pueda ser de metadona o ac. acético) y el de la muestra, los tapones se dispondrán boca arriba.

1.1 EXTRACCIÓN DE ADN DE UNA FRESA

Extracción de ADN 1.1 ADN de una fresa 1.2 ADN humano

- Fresas. -Alcohol. - Jabón de platos. - Sal. - Vasos de precipitados.

- Colador. - Agua. - Cucharas. - Bolsa zip.

Se realiza mediante la disgregación de las células de la fresa utilizando el método de trituración. 

En esta práctica realizaremos la extracción del ADN de dos organismos distintos, el objetivo es poder visualizar la cadena de ADN de manera macroscópica.

Procedimiento -Extraemos nuestro cultivo de la incubadora y procedemos, en la cabina de flujo, a introducir en el cultivo 100µl de colchicina con la micropipeta, homogeneizamos, presionando y aflojando el embolo debido a que los leucocitos y eritrocitos se encontrarán en el fondo formando un coágulo. Una vez hecho esto cerramos y sumergimos el tubo en el baño termostático a 37ºC por 45 minutos.

Hay que tener cuidado a la hora de eliminar el sobrenadante ya que si extraemos muestra afectaríamos al resultado. La pipeta en ningún momento tocará el fondo del tubo ya que en este lugar se encuentra la muestra que interesa. 

Al retirar el cultivo pasado este tiempo procedemos a introducirlo en la centrifugadora a 10´a 1500 r.p.m. Cuando el centrifugado finalice, eliminamos el sobrenadante con una pipeta Pasteur de trabajo y poner el desecho en un vaso de precipitado. 

¿Qué es la colchicina y para qué la usamos en esta práctica? Es un fármaco antimitótico, es decir detiene el proceso de la mitosis destruyendo el huso mitótico. Evita en concreto la metafase por lo tanto lo que veremos será la cromátida transformada en cromosomas.

Añadiremos con la segunda pipeta Pasteur 8 ml de una disolución de KCl gota a gota el primer mililitro, y homogeneizaremos la mezcla con el fin de plasmolizar los eritrocitos eliminándolos en los futuros lavados. 

Tenemos un bote de KCL sólido y debemos preparar una disolución con x gramos de este y 0,5 L de agua destilada a 0,07M. Calculamos: M= (n (mol)/V(L)) 0,07M= n/0,5 = 0,0375 mol de KCl El peso molecular de KCl= 74,55 g/mol La masa de KCl que usaremos será: 0,0375mol*74,55g/mol=2,79 g de KCl usaremos.

Se deja incubar en baño termostático 20 . Plasmolizar: proviene de la plasmólisis, los eritrocitos al hallarse en un medio salino concentrado se contraerán y al no recuperar el agua que perdieron morirán.

Para fijar la muestra introduciremos 1 ml de fijador de Carnoy con la ayuda de la micropipeta, es importante realizarlo gota gota. Una vez esté introducido homogeneizaremos con una pipeta Pasteur limpia, muy despacio para que no se rompan las células. Repetiremos el mismo proceso pero con 4 ml de fijador de Carnoy.

Este paso se le denomina choque hipotónico ya que se suspende las células en una concentración hipotónica, consiguiendo que las células se hinchen obteniendo la separación de los cromosomas. Esto se produce en los leucocitos.

Procedemos a realizar lavados con el fijador mediante la centrifugación a 1.000 rpm durante 5 minutos y, cuando el proceso termine volveremos a repetir el paso de fijación anterior. Introduciremos el tubo nuevamente en la centrífuga y la accionaremos. 

-Tubo cónico esférico -Sangre en 2 tubos EDTA -Gradilla -Puntas de pipetas estériles desechables.

Procedimiento Antes de proceder a la práctica en sí, se debe desinfectar adecuadamente la cabina de flujo y atemperar el medio de cultivo a 37ºC

-Vaso de precipitado. -Medio de cultivo Pasarín 701 enriquecido con fitohemoglutinina. -Micropipeta ajustable.

-Se procede a extraer la sangre rellenando 2 tubos EDTA. Dentro de la cabina de flujo: Tomamos 5ml de Paserín y lo depositamos en el tubo cónico. Hay que tener en cuenta de que en el momento de realizar la apertura tanto del tubo como el medio de cultivo, los tapones los tenemos que dejar boca arriba ya que de lo contrario tendrían riesgo de contaminarse.

-Presionamos una punta de pipeta en la macro pipeta y procedemos a pipetear dentro del frasco. Cambiamos la punta de pipeta cuando cambiemos de reactivo. -Cerramos el frasco para evitar contaminación.

*Panóptico rápido: tinción que permite diferenciar el núcleo y los gránulos celulares de color violeta.

VISULIZACIÓN DE DISTINTAS FASES DE MITOSIS EN MERISTEMO DE CEBOLLA

El objetivo de la práctica es presenciar una determinada fase de la mitosis, mediante la aplicación de colchicina para detener el proceso y así poder observarlo.

Los meristemos se encuentran en las raíces de la cebolla, utilizamos este tejido porque se encuentra en constante división (crecimiento del vegetal).

-Cebolla previamente sumergida en agua durante 4 días. -Colchicina. -Portaobjetos. -Panóptico rápido.

En nuestra práctica no utilizamos colchicina porque no disponíamos del tiempo necesario para que esta actuara. Por este motivo procedemos de la siguiente manera 1.- Cortamos una porción de la raíz. 2.- Lo colocamos en el portaobjetos y posteriormente ejercemos presión con el cubreobjetos. 3.- Procedemos a teñir sin el cubreobjetos.

4.- Lavamos el exceso de tinte y dejamos que se seque en papel

Cuando esté seco, vamos al microscopio y observamos la muestra. Se puede ver las células realizando la división celular, parece ser que nos encontramos en metafase

Al procesar la muestra sin colchicina no se ha podido apreciar con exactitud la fase de la mitosis en la que se encuentran las células. 

¿Para qué sirve el detergente como reactivo?

En cuanto al ADN humano:

El detergente disuelve la membrana celular de los tejidos, así como las grasas que como sabemos son el principal componente de la membrana plasmática y nuclear. Una vez la membrana rota el material genético queda libre y de esta manera podemos extraerlo.

¿Cuál es la función del vinagre usado como reactivo?

Su papel es la eliminación de las proteínas contaminantes del ADN, también ayuda a observar mejor el material genético

El papel del alcohol en ambas extracciones:

¿Cuál es la importancia de la sal en la práctica?

Interviene en el proceso de separación de las proteínas unidas al ADN Los iones sodio y cloruro los cuales conforman la sal común neutralizan las cargas negativas del ADN, adicionalmente los cationes Na+ anulan las cargas negativas de los fosfatos del ADN.

Disminuye la constante dieléctrica de la solución acuosa, al estar enfriado provoca que al entrar en contacto con el ADN se separe del agua y precipite. 

Repetiremos el paso de fijación hasta que el precipitado esté limpio y transparente, tantas veces como haga falta. Pero como el tiempo de clase no fue suficiente no realizamos este último paso

Finalmente extendemos en un porta esto se hace para que los linfoblastos rompan su membrana y los cromosomas puedan extenderse, echaremos dos gotas a una altura determinada (5 a 10cm) en cada lado del porta de altura.

Realizamos este tipo de tinción porque esta es característica para visualizar las células sanguíneas. Los tinte utilizados son: -Disolución metanólica de colorante de triarilmetano. -Disolución acuosa tamponada de xanteno. -Disolución acuosa tamponada de colorantes derivados de la tiazina.

Para poder visualizar la muestra procedemos a realizar una tinción panóptico rápido

Conclusiones En mi caso sólo se pudo apreciar la presencia de linfoblastos mas no sus cromosomas en mitosis, puede ser que que haya cometido un error en el momento de la homogenización ya sea en la mezcla con la colchicina o la disolución de KCl.

En el vaso de precipitados preparamos la mezcla de extracción de ADN, ponemos 90 ml de agua, junto con 10 ml de jabón para platos, una cucharadita de sal  y mezclamos lentamente hasta que la sal se disuelva sin que el jabón genere espuma.

Colar la mezcla y recogerla en el vaso de extracción preparado anteriormente. Aplastar ligeramente la mezcla en el colador para sacar el máximo de zumo posible

Depositar las fresas en la bolsa zipper, para proceder a triturarla con el pistilo. Haremos esto hasta que se forme una masa de pulpa.

Añadir al líquido resultante 5 ml de alcohol frío procedente de la nevera. Se forma una sustancia blanquecina en el parte superior, siendo esto el ADN extraído de la fresa.

¿Para qué sirve el carnoy? El fijador de carnoy se utilizará más adelante, su función es preservar ácidos nucleicos y glucógeno.

2.2 Cultivo de sangre periférica de linfocitos

El objetivo de esta práctica es la conservación de la muestra junto con los linfocitos a cultivar.

pipeteamos el reactivo dentro del frasco.

¿Para qué homogeneizamos? En el caso de la sangre, para que toda la muestra contenga la misma cantidad de leucocitos, eritrocitos, hematíes...y también para evitar la formación de coágulos. Cuando tenemos en el tubo cónico el medio de cultivo más la muestra de sangre homogeneizamos para que la mezcla resultante sea uniforme.

Objetivo de la práctica El objetivo que desea alcanzar en esta práctica es poder visualizar los cromosomas en mitosis, concretamente en metafase. Para esto los linfocitos cultivados anteriormente se romperán tras realizar los distintos procesos descritos a continuación.

-Pipeteamos la muestra y la introducimos en el tubo cónico, lo cerramos y homogeneizamos. -Introducimos nuestro cultivo en la incubadora durante 48 horas.

Se cambia de punta y se dispone la micropipeta a una medida de 400 µ. Antes de transportar la muestra sanguínea al tubo cónico se debe homogeneizar el tubo EDTA, lo haremos de la siguiente manera: -Tomaremos una pequeña muestra y soltaremos dentro del mismo tubo sin sacar la micropipeta de esta, es decir con un movimiento vaivén, lo realizaremos un par de veces.

Materiales -Estufa de incubación. - Baño termostático. -Colchicina. -Cultivo de sangre. -Micropipeta. -Puntas de micropipeta

-Centrífuga. -Vaso de precipitado. -KCl. -Tres pipetas Pasteur estériles.

Realizamos la extracción usando los mismos reactivos añadiendo el vinagre, no necesitamos el proceso de trituración ya que la muestra la conseguimos con un breve enjuague bucal. No he conseguido ver las hebras con exactitud ya que el alcohol utilizado no era el adecuado.

Conclusión

La fresas utilizadas en esta práctica son cultivadas tiene 56 cromosomas por este motivo al extraer el ADN se puede apreciar de manera macroscópica.